Científicos en Japón han utilizado la tecnología CRISPR-Cas9 para detener la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) en células T infectadas de forma latente que no se pueden controlar con los tratamientos farmacológicos existentes. El enfoque de edición de genes interrumpe eficazmente dos genes reguladores del VIH-1, tat y rev , que son esenciales para la replicación viral. Al describir sus estudios in vitro en Informes Científicos , los investigadores de la Facultad de Medicina de la Universidad de Kobe y la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Kobe dicen que los resultados iniciales indican que usar CRISPR-Cas9 para dirigir genes reguladores del VIH-1 puede ofrecer un nuevo enfoque para lograr " curas funcionales ".
"Estos resultados muestran que el sistema CRISPR-Cas9, al apuntar a los genes reguladores del VIH-1, tat y rev , es un método prometedor para tratar la infección del VIH", comenta el coautor Masanori Kameoka, Ph.D., profesor asociado. en la Escuela de Posgrado de Ciencias de la Salud de la Universidad de Kobe. "Ahora tenemos que investigar cómo podemos introducir selectivamente un sistema CRISPR-Cas9 que se dirige a los genes del VIH-1 en las células infectadas de los pacientes".
El trabajo publicado del equipo, en coautoría con el Dr. Kameoka, y los co-investigadores Youdiil Ophinni, Ph.D., Mari Inoue, Ph.D., y Tomohiro Kotaki, Ph.D., se titulan " CRISPR / Cas9 System Targeting" Los genes reguladores del VIH-1 inhiben la replicación viral en cultivos de células T infectados ".
El VIH-1 infecta a unas 35 millones de personas en todo el mundo y, aunque la terapia antirretroviral de por vida puede ayudar a convertir lo que de otra forma sería una infección mortal en una enfermedad crónica más "manejable", los tratamientos actuales no son una cura porque no pueden erradicar por completo. virus, que inserta sus genes en el ADN de las células del huésped, explican los autores. A pesar del tratamiento con ART, el VIH-1 continúa replicando a un nivel muy bajo en algunos tipos de células del sistema inmunitario latentemente infectadas, como las células CD4 + , los macrófagos y las células dendríticas foliculares. "Los compuestos antivirales actuales son incapaces de apuntar al genoma proviral integrado dentro de estos reservorios celulares y se produce un rápido rebote viral después del cese del TAR", explican. El virus también puede ocultarse en tejidos como el sistema nervioso central.
Las células T CD4 + han sido las más estudiadas de las reservas celulares en las que el VIH-1 puede persistir. Una pequeña fracción de las células T CD4 + en reposo albergará el VIH-1, incluso durante el TAR, y se considera que es "el mayor obstáculo para la erradicación del VIH-1", señalan los autores. "La infección latente por VIH-1 en células T CD4 + en reposo es la principal causa de la barrera para una curación funcional". Sugieren que una "intervención única para eliminar la persistencia genómica viral representa un enfoque sensato y prometedor para lograr una infección por VIH". 1 cura funcional. "
Un posible enfoque para erradicar el VIH-1 de dichos reservorios es alterar directamente el genoma provírico utilizando herramientas de edición del genoma. Desafortunadamente, tecnologías como la nucleasa de dedo de zinc (ZFN) y la nucleasa efectora de tipo transcriptor-activador (TALEN) han demostrado ser problemáticas debido a "dificultades asociadas con el diseño, síntesis y validación de proteínas para un locus genético específico de interés".
El equipo de Kobe University Graduate School ha desarrollado un enfoque alternativo utilizando la edición de genes CRISPR-Cas9 para interrumpir dos genes virales reguladores, tat y rev , que son esenciales para la replicación viral y que también están altamente conservados en diferentes subtipos de VIH-1.
Los científicos generaron seis RNA de guía (gRNA) -tres tat de orientación y tres de orientación- rev para dirigir la enzima Cas9 que escinde ADN a los sitios relevantes en el ADN proviral. Ellos empacaron los gRNA y el sistema enzimático Cas9 en un vector lentiviral, que luego podrían introducir en células cultivadas.
Los estudios iniciales demostraron que el vector abolió de manera efectiva la expresión de tat y rev en células cultivadas que se diseñaron para expresar los genes. Los genes diana fueron mutados en los sitios de escisión de Cas9 con "alta frecuencia y varias mutaciones indel [inserción / eliminación]", escriben los autores. Alentadoramente, la transducción CRISPR-Cas9 de células T humanas no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular, y no hubo mutaciones detectables fuera del objetivo en el ADN humano.
Los constructos CRISPR también dirigieron la expresión tat y rev en células T CD4 + infectadas de forma latente , "demostrando que la administración lentiviral del sistema CRISPR / Cas9 alcanzó con éxito y escindió el genoma proviral del VIH-1 latente", afirman. Los constructos también suprimieron marcadamente la reactivación del VIH-1 dependiente de citocinas en células infectadas de forma latente e inhibieron la replicación viral en células infectadas persistentemente. El equipo dice que estos resultados "demostraron que la administración lentiviral de CRISPR / Cas9 alcanzó con éxito el genoma provírico aislado, escindió genes reguladores e inhibió significativamente la replicación viral, incluso después de la reversión de la latencia".
Afirman que la capacidad de transducir células no divididas, tales como células T CD4 + en reposo , utilizando construcciones lentivirales y lograr la expresión transgénica de Cas9 a largo plazo respalda la posibilidad de utilizar el sistema para erradicar células que actúan como reservorios latentes de VIH-1.
Reconocen que se necesitará más investigación para traducir su trabajo temprano in vitro en modelos preclínicos in vivo y pacientes humanos. "Para poder introducir de forma segura y efectiva el sistema CRISPR-Cas9, los vectores deben mejorarse", señala el Dr. Kameoka. "Esperamos que esta investigación nos brinde información útil para desarrollar un método de tratamiento que pueda curar por completo la infección por VIH-1".
"La capacidad de los vectores lentivirales para transducir células que no se dividen, incluyendo las células T CD4 + en reposo , y mantener la expresión estable del transgén Cas9 a largo plazo respalda su uso potencial para erradicar las células infectadas que constituyen el reservorio latente", concluyeron los investigadores. "Con base en los rápidos avances logrados en la investigación CRISPR / Cas9, una cura funcional del VIH-1 pronto podría estar a su alcance".
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